ACGT Keyboard

Magazín


Množství a kvalita dat ze systému GridION

V minulém článku jsme popsali některé vlastnosti a z toho plynoucí limitace sekvenátoru Sequel (Pacific Biosciences). Pokud hledáte alternativu této technologii dlouhých readů, možná zvažujete technologii firmy Oxford Nanopore.



Množství a kvalita dat ze systému Sequel

Technologie SMRT sekvenování společnosti Pacific Biosciences umožňuje sekvenaci jak fragmentů s délkou v řádu desítek kilobází, tak fragmentů dlouhých pouze několik stovek bází.



Sekvenace knihoven s nízkou sekvenční diverzitou na platformě Illumina

Sekvenační technologie Illumina na trhu aktuálně dominuje. Poskytuje celou řadu výhod ve srovnání s ostatními technologiemi, ale to bohužel neznamená, že je zcela bez nedostatků.



Kvalita, rychlost nebo cena - čemu dáváte přednost v Sangerově sekvenování?

Podobně jako asi málokdo vyrazí do divadla či na sportovní zápas, aniž by věděl, co je na programu nebo kdo proti komu hraje, i v případě objednání různorodých služeb je normální mít předem alespoň trochu představu, co od poskytovatele dané služby mohu čekat. Od konkrétních požadavků se přirozeně odvíjí to, jak KVALITNĚ, RYCHLE a ZA JAKOU CENU danou službu mohu získat, což samozřejmě platí i v oblasti DNA sekvenování. Je pochopitelné, že většina klientů by byla ráda, aby byla všechna tato tři kritéria splněna současně na 100 %, ale naprosto otevřeně říkáme, že to není v podstatě možné.



Ještě jednou o servisu sekvenátorů Applied Biosystems 3130/xl

Možná jste zaznamenali naše Prohlášení z června roku 2017, kdy jsme informovali o tom, že navzdory blížícímu se termínu možného ukončení podpory oblíbených a hojně používaných sekvenátorů Applied Biosystems 3130/xl ze strany výrobce (společnosti Life technologies) ke konci roku 2018, my ve firmě SEQme garantujeme jejich servisní a aplikační podporu i po tomto datu.



Nové horizonty v Next-Generation sekvenování (NGS) s technologií GemCode (10x Genomics)

Náš neustálý zájem nalézt nejvhodnější technologická řešení pro Vaše experimenty nás dovedl k zavedení technologie GemCode do naší nabídky služeb v oblasti Next-Generation sekvenování. Tímto příspěvkem hrdě oznamujeme dostupnost této technologie v naší laboratoři a zároveň představujeme její základní vlastnosti.



Několik důvodů, proč je pro kvantifikaci vzorků na přípravu NGS knihoven lepší Qubit než Nanodrop

Kdybych dostal zaplaceno pokaždé, když odpovídáme na otázku “Jak mám měřit koncentraci DNA nebo RNA na přípravu NGS knihovny?”, tak bych nepsal tento příspěvek. Byl bych někde na jachtě okolo řeckých ostrovů. Ale jelikož na žádné jachtě nejsem, říkal jsem si, že bych mohl dát dohromady několik dobrých důvodů, proč není používání Nanodropu pro tyto účely zrovna ten nejlepší nápad.



Nízká koncentrace templátu pro sekvenování a co s ní lze dělat?

Správná (a dostatečná) koncentrace templátu je pro úspěch sekvenačních analýz naprosto zásadním parametrem. Pokud nemáte požadované množství templátu k dispozici, můžete snížit celkový objem zasílaných vzorků při dodržení koncentrace templátu i primeru. Navýšení objemu vzorku při zachování nízké koncentrace není řešením...



Prohlášení společnosti SEQme k avizovanému ukončení podpory přístrojů Applied Biosystems 3130/xl ze strany výrobce

Společnost Life Technologies vydala 3. března 2015 tzv. Termination letter, týkající se plánovaného ukončení podpory přístrojů 3130/xl. V tomto dopise, který jste možná rovněž obdrželi, se m.j. uvádí, že podpora těchto přístrojů je ze strany výrobce zajištěna cituji "nejméně do prosince 2018"...



Kvalitnější začátek sekvence – modifikované primery

Zcela běžnou součástí sekvenačního elektroferogramu je kvalitativně zhoršený (respektive nečitelný) úplný začátek sekvence. První očekávanou zobrazitelnou bází by teoreticky mohla být první báze za sekvenačním primerem. Ve skutečnosti však zpravidla přibližně 20 bází za primerem nelze spolehlivě přečíst ...



Jak přímo sekvenovat velké templáty?

Jedním z občas se objevujících požadavků je i dotaz na přímou sekvenaci velkých templátů, např. chromozomální DNA, BAC vektory, kosmidy apod. V principu to možné je, ale stejně jako u standardních reakcí, kdy je templátem krátký pcr produkt nebo plazmid, je i zde potřeba dodržet jeden základní požadavek, kterým je správné množství templátu.



Jak pracujete s .ab1 soubory?

Výsledky Sangerova sekvenování jsou poskytovány ve třech typech souborů a ne každý uživatel tuší, jaké možnosti jednotlivé soubory poskytují a jak s nimi efektivně pracovat. Sepsali jsme pro tyto účely stručný návod.



Je nutné měřit referenční gen(y) ve stejném běhu jako geny vašeho zájmu?

Provádíte-li relativní kvantifikaci, velmi pravděpodobně vás zajímá porovnání expresní hladiny určitého genu mezi vzorky. Nejběžnější způsob, jak eliminovat variabilitu v množství nukleových kyselin v jednotlivých vzorcích, je normalizace za použití referenčních genů.



Vlastníte Applied Biosystems 7900HT? Máte štěstí!

Viděli jste někdy Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR systém? Pokud jste nevěděli, na co se vlastně díváte, asi se vám nelíbil. Podle mého názoru je to ten nejošklivější qPCR přístroj, jaký kdy byl vyroben, šedý, velký, těžký a hlučný.



Inspekční prohlídka sekvenátoru – copak od ní čekáte?

Mnozí z našich klientů vyžadují provedení pravidelné inspekční (preventivní) prohlídky. Ať již mezi ně patříte či nikoliv, přemýšleli jste někdy nad tím, jak poznáte, že byla provedena správně?



Píše nám sám Život (anglicky Life)…

Jeden z našich dlouholetých zákazníků mne upozornil na dopis, který nedávno dostal od Life Technologies, a v kterém se píše o tématu drahém mému srdci – nezávislí poskytovatelé servisních služeb! Pokud jste měli to štěstí a dostali dopis též, rád bych ho uvedl na pravou míru.



HairpinSeq – protokol pro problematické templáty

Objednali jste si sekvenační analýzu DNA zaklonované do plazmidového vektoru či PCR produktu a výsledná sekvence je ukončena dříve než jste očekávali? Jednou z možných příčin může být skutečnost, že v templátu dochází ke vzniku sekundární struktury, nejčastěji vlásenky.



10 DŮVODŮ proč sekvenovat v SEQme

Uvažujete nad otázkou proč posílat vaše vzorky zrovna k nám? Přečtěte si 10 dobrých důvodů, které tuto otázku odpoví!



Známé neznámé DNA sekvenování - Část III

Takže řekněme, že máme dobré a stabilní signály, délka čtení je také v pořádku, takže jsme úspěšně překonali všechny trable zmíněné v prvních dvou částech tohoto textu, ale pořád můžeme být daleko od dobrého výsledku sekvenace. Třetí a poslední část je věnována situaci, že se píky vzájemně překrývají. Sekvence je nečitelná.



Známé neznámé DNA sekvenování - Část II

V první kapitole jsme se věnovali problémům s žádným nebo velmi slabým fluorescenčním signálem. Bylo to v zásadě o prázdných elektroferogramech. Velmi frustrující záležitost. Teď pokročíme k další jen o málo menší nepříjemnosti – v reakcích pozorujeme nějaký signál, ale výška píků rychle klesá. Délka čtení je velmi krátká.



Známé neznámé DNA sekvenování - Část I

Cílem tohoto textu není detailní rozbor všech problémů, na které můžete narazit při vyhodnocování vašich výsledků. Ani by to nemělo smysl, protože jich je příliš mnoho. Naštěstí naprostá většina chybných výsledků vzniká v důsledku několika málo „základních“ chyb, jejichž odstranění není ve většině případů nijak složité, a na ty se zaměříme. Nebudeme se zabývat problémy vzniklými v důsledku chyb hardwaru (sekvenátorů) ani sekvenačních reagencií používaných v naší nebo kterékoliv jiné sekvenační laboratoři, jednoduše proto, že jako uživatelé je stejně nemůžete ovlivnit a je naší zodpovědností dodat vám výsledky v takové kvalitě, abyste tyto potíže ani nezaznamenali.



Znečišťování DNA na čistících kolonkách

Při přečišťování templátů pro DNA sekvenování (plazmidů nebo PCR produktů) se často využívají centrifugační kolonky v nichž je DNA navázána na silica matrici. Bohužel některé kolonky (i renomovaných výrobců!) mají takový tvar, že spíše než k přečištění dojde k znečištění templátu.



Několik poznámek k analýze dat

Technologie next-generation sekvenování produkují v porovnání se Sangerovou technologií obrovská množství dat. Jejich objem pochopitelně závisí na designu experimentu, primárně však na výstupní kapacitě přístroje. V principu je však vždy potřeba vypořádat se s převedením velkého množství dat do takové podoby, kdy je možné s nimi smysluplně pracovat, aby byla možná hlubší analýza získaných sekvencí, která je cílem celého experimentu.



Stručný slovník NGS pojmů

Vysvětlení nejběžnějších pojmů Next-Generation sekvenování.


© SEQme s.r.o., 2012 - 2019. Všechna práva vyhrazena. Právní upozornění.
webdesign Beneš & Michl