Technologie SMRT sekvenování společnosti Pacific Biosciences umožňuje sekvenaci jak fragmentů s délkou v řádu desítek kilobází, tak fragmentů dlouhých pouze několik stovek bází. U dříve používaného systému PacBio RSII se vyskytoval problém s nanášením fragmentů v délce 500 – 1 000 b. Pro fragmenty kratší než cca 500 b byla používána metoda difuze, která ovšem umožňovala maximálně 40% loading, a navíc se u ní projevovala výrazná tendence k efektivnějšímu loadingu kratších fragmentů. Pro fragmenty delší než 1 000 b se dala již efektivně použít metoda nanášení pomocí paramagnetických kuliček. Nanášení fragmentů mezi 500 – 1 000 b bylo však velice problematické. Nejen kvůli tomuto důvodu je sekvenátor RSII v dnešní době již zastaralý, ačkoliv byl na trhu jen krátce, a jeho používání naše společnost nedoporučuje.

Při loadingu SMRT čipů pro systém Sequel, což je technologický následník modelu RSII zmíněného výše, a na kterém aktuálně analyzujeme vaše vzorky, je použit tzv. pre-extension step, který eliminuje zmíněné nedostatky nanášení vzorku difuzí. Díky tomuto kroku lze difuzi využít i pro knihovny s až 15 kb dlouhými fragmenty. Delší knihovny se dále nanášejí pomocí paramagnetických kuliček. Tím je dosaženo situace, kdy pro různě dlouhé knihovny můžeme počítat s podobně úspěšným loadingem a výsledná sekvenační kapacita je pak násobkem počtu readů a délky readů.

Jaké ready však vlastně systém Sequel generuje?

1. Polymerázové ready (polymerase reads) – jsou produktem neustálého čtení templátu dokola (cirkulárně), dokud nedojde k rozpadu komplexu templát:polymeráza. V tomto readu se tedy za předpokladu, že templát prošel sekvenací více než jednou, opakuje sekvence adaptor-sense vlákno-adaptor-antisense vlákno. Tento read má přesnost čtení 80-90% (QV7-10) s vysokým výskytem InDelů.
2. Sub-ready – je jich několikanásobně více než readů polymerázových a jsou to sekvence sense a antisense vláken „vystříhané“ z polymerázových readů. Sub-ready mají stejnou kvalitu čtení jako polymerázové ready.
3. Circular-consensus sequences (CCS) – vznikají porovnáním sub-readů. Jsou v nich opraveny chyby (vzájemným srovnáním sub-readů) a jejich přesnost může dosahovat až 99,999% (QV50) v závislosti na dostatečném počtu sub-readů. Na obrázku jsou pojmenované jako „Highly accurate long reads“.

Je zřejmé, že takto vysoké přesnosti čtení nelze dosáhnout u templátů všech délek. Rychlost sekvenace technologií SMRT je 3-4 b/s. Maximální doba sekvenace je 20h. Teoreticky může být tedy dosaženo až ~300 kb polymerázových readů. Kvalita těchto readů ale bude velmi špatná, jelikož polymerázový read bude sám sobě pouze jedním sub-readem.

Celý tento koncept vede ke skutečnosti, že sekvenační výstup v podobě počtu bází velmi závisí na charakteru vstupního materiálu (amplikony vs. gDNA, HMW gDNA vs. degradovaná gDNA) a na následném způsobu zpracování vzorku, kdy můžeme zařadit krok fragmentace a cílit na kratší a kvalitní výsledné sekvence, nebo na delší méně kvalitní.

Příkladem jsou diagramy, které ukazují, že s kratšími fragmenty paradoxně dosáhnete celkově většího sekvenačního výstupu.

 
Možná Vám připadne, že by tomu mělo být naopak, ale je potřeba uvědomit si následující:

• Knihovny <20 kb - Krátké polymerázové ready = velký počet sub-readů = vysoká kvalita CCS readů = velké množství kvalitních dat
• Knihovny >20 kb - Dlouhé polymerázové ready = malý počet sub-readů = nízká kvalita CCS readů = velké množství readů nesplňuje požadovanou kvalitu a jsou z výsledného datasetu odstraněny

Danou situaci ještě lépe vystihuje další diagram:

Při plánování sekvenování technologií PacBio prosím vezměte tyto skutečnosti v potaz, případně nás kontaktujte.

Obrázky převzaty z materiálů Pacific Biosciences.

NGS Lab, ngs@seqme.eu