Next-Gen sekvenování

Magazín

Aktuální přehled NGS technologií

Poslední aktualizace: 25. dubna 2019. Zájemcům o NGS technologie doporučujeme náš pravidelný dvoudenní kurz! Více informací zde.

Aktuálně nabízíme zpracování vašich vzorků pomocí následujících technologií a přístrojů. S ohledem na rychlý technologický vývoj je možné, že přes veškerou snahu nejsou níže poskytnuté informace stoprocentně aktuální. Orientační srovnávací přehled přístrojů naleznete na tomto odkazu, v případě potřeby nás prosím kontaktujte.

 

NovaSeq6000, MiSeq (Illumina)

 

Sekvenátory Illumina disponují aktuálně nejvyšší možnou přesností čtení. K dispozici máme přístroje a čipy poskytující různý výstup sekvenačních dat jak do množství, tak do délky. Vhodným výběrem nastavení lze zajistit ekonomické využití přístroje. S jedním typem technologie lze tak realizovat experimenty s různými nároky na sekvenační kapacitu. Od sekvenace malých genomů, či amplikonů na systému MiSeq po analýzu velkých genomů či RNA na přístroji NovaSeq. Je možné provést pilotní experiment s nižší kapacitou a následně dle výsledků designovat experiment většího rozsahu apod.

Aktuálně jsme se rozhodli všechny high-throughput sekvenace převést na NovaSeq (vyšší kapacita, nižší cena, vyšší kvalita dat), takže přístroj HiSeq již nemáme v nabídce.

Všechny přístroje Illumina pracují s čipem zvaným flow-cell, který je u vyšších modelů rozdělen do několika drah.

NovaSeq6000 flowcell S4 (celková kapacita 3 Tb)

Tyto dráhy lze z hlediska sekvenování považovat za oddělené jednotky. V jednom sekvenačním běhu lze tedy sekvenovat více vzorků bez nutnosti indexování. S využitím indexování lze pak analyzovat i větší množství vzorků v jedné dráze. Nejvíce pokročilou metodou v tomto ohledu je použití unikátního duálního indexování.

 

PacBio Sequel (Pacific Biosciences)

Pro některé aplikace (např. skládání genomů nebo čtení delších amplikonů a repetitivních sekvencí) je potřeba získat delší sekvence. Toto je schopna poskytnout technologie SMRT využívaná v přístrojích společnosti PacificBiosciences. Délka přečtených fragmentů může být v průměru až 30 kb při vysoké kvalitě čtení. Při přípravě vzorku pro sekvenaci nedochází oproti jiným technologií k amplifikaci templátu a je tedy možné zaznamenat přímo i některé epigenetické modifikace.

Templátem pro sekvenaci je cirkularizovaná molekula. Na tuto molekulu nasedá polymeráza a čte ji tak dlouho, dokud opět neodpadne či neskončí sekvenační běh. Fragmenty dlouhé řádově několik desítek kb  jsou takto opakovaně přečteny a porovnáním jednotlivých čtení, které provádí přístroj automaticky, je dosaženo zpřesnění správné identifikace báze. Tato strategie se nazývá „circular consensus sequencing“. Už při pročtení řádově 8-10x je přesnost čtení vylepšena na více než 99,99%, což je srovnatelné s přesností technologie Illumina.

(obr. upraven podle dokumentace PacificBiosciences)

 

GridION (OxfordNanopore)

Další technologií, která se zaměřuje na produkování dlouhých sekvencí je technologie společnosti OxfordNanopore. V literatuře jsou již nyní popsány experimenty, kdy byly získány sekvence čítající až 300 kb a délka čtení je v zásadě omezena pouze integritou nukleové kyseliny. Tato technologie zároveň pracuje s přímou detekcí bází, bez nutnosti amplifikace templátu, tudíž má potenciál i v přímé detekci epigenetických modifikací.

Technologie OxfordNanopore se stále potýká s pověstí horší kvality sekvenování. Pravdou je, že překlad signálu na báze byl a stále je bolavým místem této technologie, neboť i přes neustálý a rychlý pokrok v této oblasti dosahuje přesnost čtení maximálně zhruba 95%. Stále je však možnost kombinovat dlouhé nepřesné sekvence s krátkými přesnými a získat tak daleko lepší de-novo assembly než by poskytly samotné krátké ready získané technologií Illumina. Navíc pokrok v dekódování signálu je velmi rychlý a i "stará" data lze přeanalyzovat s novými algoritmy.

 

Chromium Controller (10xGenomics)

Přístroj Chromium Controller do této sekce de-facto nepatří, jelikož to není sekvenátor, ale systém pro přípravu sekvenačních knihoven, má však určité zajímavé technologické možnosti. V sekvenační knihovně vytvořené tímto přístrojem jsou všechny fragmenty pocházející z jedné konkrétní molekuly (>50 kb dlouhé) opatřeny totožnou identifikační sekvencí (barkódem), což umožňuje získané krátké sekvence seskupit dle jejich příslušnosti k mateřské molekule a získat tak unikátní přidanou informaci, která v konečném důsledku umožňuje daleko přesnější zpracování dat. Přístroj je takto schopen využít až 750.000 různých barkódů.

Druhou atraktivní možností tohoto přístroje je označit unikátním identifikátorem všechny polyA RNA pocházející z jedné buňky. Tím se otevírají netušené možnosti studia exprese individuálních buněk.

 

Petr Vácha, ngs@seqme.eu

© SEQme s.r.o., 2012 - 2019. Všechna práva vyhrazena. Právní upozornění.
webdesign Beneš & Michl