Real-Time PCR

Magazín

Je nutné měřit referenční gen(y) ve stejném běhu jako geny vašeho zájmu?

Provádíte-li relativní kvantifikaci, velmi pravděpodobně vás zajímá porovnání expresní hladiny určitého genu mezi vzorky. Nejběžnější způsob, jak eliminovat variabilitu v množství nukleových kyselin v jednotlivých vzorcích, je normalizace za použití referenčních genů. Máte-li genů a vzorků mnoho, musíte se rozhodnout, jak je uspořádáte do jednotlivých destiček (běhů).

K dispozici máte v zásaddě dvě metody – co nejvíc vzorků na desce (sample maximization) a co nejvíc genů na desce (target maximization - Hellemans et al., Genome Biology 2007, 8:R19). Strategie „co nejvíc vzorků“ je zcela jistě ta lepší a měli byste ji použít kdykoliv můžete, tzn. dát co nejvíc vzorků pro daný gen do jediného běhu. Nezatížíte tak výsledek chybou způsobenou variabilitou mezi běhy (protože všechny vzorky pro daný gen měříte najednou v rámci jediného běhu), takže nemusíte provést tzv. inter-run kalibraci.

Referenční geny přitom analyzujete stejně jako jakýkoliv jiný gen. Pro někoho možná překvapivá informace, ale není nutné měřit expresi referenčních genů ve stejném běhu jako geny vašeho zájmu. Dokonce je naprosto v pořádku změřit gen vašeho zájmu např. pomocí hydrolyzační sondy v jednom cykleru a normalizovat na referenční gen měřený pomocí SYBR Green I v jiném cykleru. Pokud – jako většinu experimentátorů používajících RT-qPCR – vás zajímá relativní hladina exprese, musíte zajistit, že jsou všechny vzorky zpracovány stejně; pro geny už to neplatí.

Existují nástroje pro vyhodnocení dat, které ale tuto strategii nepodporují. Například, analyzujete-li váš experiment relativní kvantifikace v jakémkoliv software Applied Biosystems, musíte mít referenční gen ve stejném běhu jako gen zájmu, jinak software výsledky nespočítá. Nejenom v takovéto situaci rozhodně doporučujeme použít nástroj pro analýzu dat, který je v souladu s nejlepšími standardy analýzy. Nabízíme vám program qbaseplus, excelentní nástroj pro analýzu dat, kompatibilní se všemi qPCR přístroji na trhu, který tyto požadavky bez výhrady splňuje.

 

Richard Nádvorník, richard.nadvornik@seqme.eu

© SEQme s.r.o., 2012 - 2019. Všechna práva vyhrazena. Právní upozornění.
webdesign Beneš & Michl