Sekvenační metoda BTSeq

BTseq™ (Barcode-Tagged Sequencing) je speciální sekvenační metoda pro sekvenátory Illumina, která umožňuje velmi levně sekvenovat templáty „sangerovského“ typu – plazmidy, pcr produkty ale i malé genomy např. bakterií nebo virů. Metoda je založena na použití speciální chemie a specifických postupů analýzy získaných dat.

Templáty až 20 kb!

Sekvenování technologií BTSeq™ poskytujeme na základě smlouvy se společností

BTSeq umožňuje sekvenování:

Dlouhých PCR amplikonů
Plazmidů
mtDNA
Malých genomů

Výhody technologie BTSeq:

Nemusíte dodávat žádné primery na sekvenování
Výsledkem jsou sekvence o délce až 20 kb
Analýza metodou BTSeq je rychlá, založená na použití speciálních barkódů a využívá i speciální NGS algoritmy pro eliminaci chyb a assembly

Velký rozsah velikostí templátů

Až 20 kb, případně delší^*
Sekvenování plazmidů s dlouhými inzerty
NGS-kvalita dat
Digitalizovaný formát výsledků

Cenově dostupná služba

Minimální náklady ve srovnání s technologiemi Sanger i "klasickým" NGS
Plně nahradí technologii primer-walking
Odpadá potřeba syntézy sekvenačních primerů

Žádná omezení typu templátu

Sekvenovat lze nepřečištěné PCR produkty
Minimální požadavky na množství vzorku - 40 ng
Sekvenování templátů všeho druhu

^*Nejdelší námi testovaný templát byl >50 kb. V případě zájmu nás kontaktujte.

Výsledky a záruka

Pro každý vzorek, který projde vstupní kontrolou kvality, získáte podobné (notoricky známé) výstupy jako při Sangerově sekvenování:

Konsensus sekvenci ve formátu fasta:

Tabulku s frekvencemi výskytu bází (Base frequency table), obsahující informace o zastoupení té které báze v dané pozici konsensus sekvence:

ab1 soubor sloužící pro vizualizaci konsensus sekvence:

Sekvence >3000 b bude rozdělena do více ab1 souborů.

Ukázka výsledků – stáhněte si vzorové výsledky pro jeden z našich testovacích vzorků!

Co byste měli vědět:

Dostanu výsledky ve standardním NGS formátu, typicky fastq? – Standardně ne. Na přání bude v budoucnu možné výstupy zpracovat i v jiné formě, než je uvedeno výše, ale v tuto chvíli to není možné.
Jaká je přesnost čtení / chybovost metody BTSeq? - Vzorky se sekvenují na přístrojích Illumina, což samo o sobě zajišťuje nejvyšší možnou přesnost čtení. Konsensus sekvence vzniká pomocí de-novo assembly, kdy parametrem spolehlivého určení báze na dané pozici je alespoň pět readů, nicméně kapacita na vzorek je nastavena tak, aby průměrné pokrytí bylo cca 150x, přesnost assembly je tedy velice vysoká i pro pozice, kde se vyskytuje více variant.
Jak se projeví na výsledcích, pokud se jedná o směsný vzorek? - Podobně jako u Sangerova sekvenování i pro metodu BTSeq je velice důležité, aby templát nebyl směsný. Sangerovou metodou získáte nečitelný elektroferogram, je-li templát směs. Při použití BTSeq dostanete pouze konsensus sekvenci templátu, který má ve vzorku vyšší zastoupení, a to i kdyby rozdíl v zastoupení byl minimální. Informativní v těchto případech bude zejména base frequency table. Sekvenovat směsné vzorky je tedy možné, ale při vědomí této limitace a v principu to spíše nedoporučujeme!
Co říká absolutní číslo v každém řádku base frequency table? - Ukazuje frekvenci výskytu jedné každé ze čtyř bazí, jak byla po deduplikaci readů a jejich zpětném namapování přiřazena na danou pozici k referenčnímu assembly (sekvenci).

Doba zpracování

Služba BTSeq je v tuto chvíli „v záběhu“ – doba zpracování je asi 6 týdnů. Doufáme, že se nám dobu zpracování podaří v budoucnu zkrátit.

Požadavky na vzorky

Dodržujte naše Pokyny pro přípravu vzorků. Vzorky musí být dodány přesně v koncentraci a objemu dle návodu! Upozorňujeme, že podobně jako u Sangerova sekvenování, ani u metody BTSeq neověřujeme koncentrace dodaných vzorků!

dsDNA – PCR produkty a plazmidy, případně genomová DNA
Velikost <20 kb
Koncentrace a objem: 2-5 ng/ul, 20 ul
Standardní čistota, PCR produkty nemusí být přečištěné
Sekvenujete-li PCR produkty nebo plazmidové inzerty, poskytněte nám informace o jejich velikosti a sekvence primerů F a R
Sekvenujete-li plazmidy, poskytněte nám informace o jejich typu, velikosti a velikosti inzertu

Všechny potřebné údaje zadáte při vyplňování našeho objednávkového formuláře.

Jak službu objednat

Analýzu lze objednat jako balíček pro 24, 48, 94 nebo 190 vzorků. Chcete-li objednat analýzu jiného počtu vzorků (např. jen několik málo vzorků nebo naopak tisíce), kontaktujte nás pro vypracování individuální kalkulace.

POZOR: Cena služby sestává 1. z ceny za laboratorní zpracování a 2. z ceny za assembly konsensus sekvence. Laboratorní zpracování má fixní ceny na balíček vzorků (24-48-94-190). Analýza dat je ale počítána za vzorek (!), nikoliv na balíček vzorků, a její cena závisí na délce složené sekvence. Nejsme proto schopni Vám říci celkovou cenu dopředu, ale až po provedení analýzy podle získaných sekvencí!

Všechny ceny jsou uvedeny v našem ceníku.

Sekvenační metoda BTSeq