Analýza metagenomu

Chcete-li analyzovat výskyt mikroorganizmů v určitém prostředí, je sekvenování metagenomu velmi efektivním nástrojem první volby, protože umožňuje identifikaci všech druhů v testovaných vzorcích.

Nejčastěji používaná strategie je založena na sekvenování amplikonů získaných amplifikací vybraných genů nebo jejich hypervariabilních oblastí. Typicky se jedná o geny pro ribozomální podjednotky (jako 16S, 18S nebo ITS) ale zdaleka nejen o ně. Tyto geny nebo genové oblasti jsou již tradičně využívány k identifikaci organizmů na základě srovnání získaných sekvencí s referenčními databázemi.

Alternativním přístupem je shotgunové sekvenování celého vzorku případně metatranskriptomická analýza. V případě zájmu o tyto služby nás prosím kontaktujte.

Analýza metagenomu pomocí amplikonového sekvenování

Srovnání výstupů Illumina vs. Oxford Nanopore: Technologií Illumina lze rozlišit pouze rod Bifidobacterium, technologií Oxford Nanopore lze určit jednotlivé druhy, např. Bifidobacterium breve atd.

Laboratorní zpracování

Naše laboratorní strategie je navržena tak, aby byla dostatečně robustní pro různé typy vzorků. Vaše vzorky budou zpracovány tímto postupem:

• Amplifikace vybraných genů nebo hypervariabilních oblastí
• Vytvoření sekvenačních knihoven 
• Kvantifikace knihoven pro dosažení maximálně vyrovnaného sekvenačního výtěžku
• Sekvenování a analýza dat (volitelně)

Jaké PCR primery používáme pro taxonomickou analýzu?

Pro sekvenační taxonomickou analýzu lze použít různé geny nebo hypervariabilní genové úseky. Primerové kombinace, které používáme pro amplifikaci, jsou průběžně doplňovány a nabídka je rozšiřována. Aktuální dostupné kombinace naleznete v Průvodním dokumentu, jehož vyplnění je povinnou součástí objednávky této služby.

Nenašli jste primery, které potřebujete? - Kontaktujte nás!

Výsledky a záruka

• Pro každý vzorek, který projde vstupní kontrolou kvality, byste měli získat minimálně 10.000 nebo 20.000 readů podle zvolené technologie, tento výstup nicméně není garantován a to s ohledem na specifika toho kterého vzorku. Na přání je možné sekvenační výstup navýšit (zpoplatněno).
• Získané sekvence budou roztříděny dle kombinace indexů do souborů reprezentujících jednotlivé vzorky a bude provedena analýza ukazatelů kvality sekvenace, jako je počet a délka sekvencí, phred score, %GC atp.
• Jako výstup obdržíte data ve formátu FASTQ rozdělená do souborů dle jednotlivých vzorků. Na přání lze výstupy zpracovat i v jiné formě. Tento požadavek prosím uveďte při objednání.

Analýza dat K laboratornímu zpracování vzorků lze současně objednat i analýzu dat. Výsledky budou zpracovány v přehledné formě (tabulky, grafy) a budou demonstrovat semikvantifikované zastoupení mikroorganismů. Máte-li již hrubá data k dispozici, můžete objednat jejich analýzu samostatně.

Analýza dat typicky zahrnuje: Kontrolu kvality dat (FastQC a MultiQC), Trimming adaptérů a nekvalitních bází, Vlastní metagenomickou analýzu, která využívá databázi Silva (16S/18S) nebo UNITE (ITS), Výsledkem jsou grafy taxonomických četností jednotlivých kategorií a jednotlivých vzorků, Další vizualizace výsledků se provádí pomocí nástroje Krona (viz obrázek výše). Na vyžádání vám poskytneme demo data!

Kurz nebo workshop

• Máte-li zájem naučit se analyzovat získaná data, navštivte náš pravidelně organizovaný workshop!
• Začátečníkům doporučujeme rovněž účast na našem dvoudenním úvodním kurzu NGS.

Požadavky na vzorky

Dodržujte naše Pokyny pro přípravu vzorků.

• Vzorky musí být dodány přesně v koncentraci dle návodu! Příliš nízká koncentrace by mohla vést k nízkému výtěžku PCR, vysoká koncentrace k rozdílným výtěžkům nebo i inhibici reakce (vysoká koncentrace DNA může být spojena s vysokou koncentrací inhibitorů). Při izolaci DNA mějte na paměti, že častější promytí a nižší výtěžek je určitě lepší než vyšší výtěžek s inhibitory. Vzorky na metagenomické analýzy prosím dodávejte ve stripech nebo 96-jamkových destičkách.
• Je doporučeno, aby alespoň jeden z Vámi zaslaných vzorků byla negativní kontrola. Jako vhodnou kontrolu lze např. použít čistou vodu, z níž „izolujete“ DNA pomocí stejné procedury jako z reálných vzorků (protože ne všechny izolační soupravy jsou DNA-free). My vždy přidáme naši vlastní negativní a pozitivní kontrolu.
• Upozorňujeme, že úspěch analýzy velmi závisí na integritě a čistotě DNA, kterou nám dodáte! Použití degradované nebo kontaminované DNA vede ke vzniku amplifikačních artefaktů. Kontaminace, které interferují s amplifikací, představují pochopitelně rovněž komplikaci. Doporučujeme během izolace DNA odstranit RNA.

Jak službu objednat

Sekvenování metagenomu lze objednat jako balíček od 24 vzorků výše. Chcete-li objednat analýzu jiného počtu vzorků (např. jen několik málo vzorků nebo naopak tisíce), kontaktujte nás pro vypracování individuální kalkulace.

 OBJEDNAT