Kvalita DNA velmi silně ovlivňuje výsledek přípravy knihovny a výtěžek sekvenace na sekvenátorech Pacific Biosciences. Pro tyto sekvenátory je bezpodmínečně nutné, aby vstupní DNA byla v co nejvyšší kvalitě a odpovídajícím množství. Cílem přípravy vzorku je co nejméně fragmentovaná DNA co nejvyšší čistoty.

Pokyny uvedené níže jsou podmínkou dosažení nejlepšího výsledku sekvenace:

• Dodržujte naše Pokyny pro přípravu vzorků.
• Pokud umíte použít některou z klasických metod izolace HMW DNA, použijte ji a vyhněte se komerčním kitům. Případně se inspirujte zde.
• Požívejte špičky s širokým otvorem.
• DNA musí být dvojřetězcová, jednořetězcové templáty interferují při kvantifikaci a při vazbě polymerázy. Ošetřete vzorky RNázou, abyste se zbavili RNA.
• Nevortexujte DNA, i když je to v protokolu napsáno.
• Pokud DNA přečišťujete na magnetických částicích, pipetujte velmi jemně a přidejte dodatečnou inkubaci při vazbě a eluci DNA na/z částic. Ujistěte se, že ve vzorku nezůstal zbytek těchto částic, mohly by působit inhibičně.
• Vzorky by měly být eluovány do pufrů podobného složení jako v sadách Qiagen (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8.5). Po izolaci gDNA je potřeba minimalizovat počet cyklů zamražení a tání.
• Nevystavujte vzorky interkalačním barvivům, UV záření, teplotám vyšším než 65°C na dobu delší než 1h a extrémním pH (<6 nebo >9).
• Ujistěte se, že vzorky neobsahují nerozpustné kontaminanty a že vzorek není zabarven, či kalný. Vyvarujte se přenosu kontaminantů ze zdrojového organismu (např. hem, huminové kyseliny, polyfenoly, apod.), chelatačních činidel (jako je např. EDTA >0,1 mM), detergentů (jako SDS, Triton-X100), denaturačních činidel (jako guanidinové soli, fenol) nebo divalentních kationtů kovů (jako Mg ²⁺).
• Vzorky musí mít poměr OD₂₆₀/OD₂₈₀ v rozmezí 1.8 až 2.0 a OD₂₆₀/OD₂₃₀ v rozmezí 2.0 až 2.2.
• Na závěr proveďte analýzu na gelu či přístroji pro kapilární elektroforézu (např. Agilent Bioanalyzer). Pokud Vám vzorek připadá degradovaný, proveďte znovu extrakci nebo přečištění.

Poznámky: