Sangerovo sekvenovaní

Magazín


Kvalita, rychlost nebo cena - čemu dáváte přednost v Sangerově sekvenování?

Podobně jako asi málokdo vyrazí do divadla či na sportovní zápas, aniž by věděl, co je na programu nebo kdo proti komu hraje, i v případě objednání různorodých služeb je normální mít předem alespoň trochu představu, co od poskytovatele dané služby mohu čekat. Od konkrétních požadavků se přirozeně odvíjí to, jak KVALITNĚ, RYCHLE a ZA JAKOU CENU danou službu mohu získat, což samozřejmě platí i v oblasti DNA sekvenování. Je pochopitelné, že většina klientů by byla ráda, aby byla všechna tato tři kritéria splněna současně na 100 %, ale naprosto otevřeně říkáme, že to není v podstatě možné.



Nízká koncentrace templátu pro sekvenování a co s ní lze dělat?

Správná (a dostatečná) koncentrace templátu je pro úspěch sekvenačních analýz naprosto zásadním parametrem. Pokud nemáte požadované množství templátu k dispozici, můžete snížit celkový objem zasílaných vzorků při dodržení koncentrace templátu i primeru. Navýšení objemu vzorku při zachování nízké koncentrace není řešením...



Kvalitnější začátek sekvence – modifikované primery

Zcela běžnou součástí sekvenačního elektroferogramu je kvalitativně zhoršený (respektive nečitelný) úplný začátek sekvence. První očekávanou zobrazitelnou bází by teoreticky mohla být první báze za sekvenačním primerem. Ve skutečnosti však zpravidla přibližně 20 bází za primerem nelze spolehlivě přečíst ...



Jak přímo sekvenovat velké templáty?

Jedním z občas se objevujících požadavků je i dotaz na přímou sekvenaci velkých templátů, např. chromozomální DNA, BAC vektory, kosmidy apod. V principu to možné je, ale stejně jako u standardních reakcí, kdy je templátem krátký pcr produkt nebo plazmid, je i zde potřeba dodržet jeden základní požadavek, kterým je správné množství templátu.



Jak pracujete s .ab1 soubory?

Výsledky Sangerova sekvenování jsou poskytovány ve třech typech souborů a ne každý uživatel tuší, jaké možnosti jednotlivé soubory poskytují a jak s nimi efektivně pracovat. Sepsali jsme pro tyto účely stručný návod.



HairpinSeq – protokol pro problematické templáty

Objednali jste si sekvenační analýzu DNA zaklonované do plazmidového vektoru či PCR produktu a výsledná sekvence je ukončena dříve než jste očekávali? Jednou z možných příčin může být skutečnost, že v templátu dochází ke vzniku sekundární struktury, nejčastěji vlásenky.



10 DŮVODŮ proč sekvenovat v SEQme

Uvažujete nad otázkou proč posílat vaše vzorky zrovna k nám? Přečtěte si 10 dobrých důvodů, které tuto otázku odpoví!



Známé neznámé DNA sekvenování - Část III

Takže řekněme, že máme dobré a stabilní signály, délka čtení je také v pořádku, takže jsme úspěšně překonali všechny trable zmíněné v prvních dvou částech tohoto textu, ale pořád můžeme být daleko od dobrého výsledku sekvenace. Třetí a poslední část je věnována situaci, že se píky vzájemně překrývají. Sekvence je nečitelná.



Známé neznámé DNA sekvenování - Část II

V první kapitole jsme se věnovali problémům s žádným nebo velmi slabým fluorescenčním signálem. Bylo to v zásadě o prázdných elektroferogramech. Velmi frustrující záležitost. Teď pokročíme k další jen o málo menší nepříjemnosti – v reakcích pozorujeme nějaký signál, ale výška píků rychle klesá. Délka čtení je velmi krátká.



Známé neznámé DNA sekvenování - Část I

Cílem tohoto textu není detailní rozbor všech problémů, na které můžete narazit při vyhodnocování vašich výsledků. Ani by to nemělo smysl, protože jich je příliš mnoho. Naštěstí naprostá většina chybných výsledků vzniká v důsledku několika málo „základních“ chyb, jejichž odstranění není ve většině případů nijak složité, a na ty se zaměříme. Nebudeme se zabývat problémy vzniklými v důsledku chyb hardwaru (sekvenátorů) ani sekvenačních reagencií používaných v naší nebo kterékoliv jiné sekvenační laboratoři, jednoduše proto, že jako uživatelé je stejně nemůžete ovlivnit a je naší zodpovědností dodat vám výsledky v takové kvalitě, abyste tyto potíže ani nezaznamenali.



Znečišťování DNA na čistících kolonkách

Při přečišťování templátů pro DNA sekvenování (plazmidů nebo PCR produktů) se často využívají centrifugační kolonky v nichž je DNA navázána na silica matrici. Bohužel některé kolonky (i renomovaných výrobců!) mají takový tvar, že spíše než k přečištění dojde k znečištění templátu.


© SEQme s.r.o., 2012 - 2019. Všechna práva vyhrazena. Právní upozornění.
webdesign Beneš & Michl