Sangerovo sekvenovaní

Magazín

Jak přímo sekvenovat velké templáty?

Jedním z občas se objevujících požadavků je i dotaz na přímou sekvenaci velkých templátů, např. chromozomální DNA, BAC vektory, kosmidy apod.

V principu to možné je, ale stejně jako u standardních reakcí, kdy je templátem krátký pcr produkt nebo plazmid, je i zde potřeba dodržet jeden základní požadavek, kterým je správné množství templátu. Typickým případem je sekvenování genomické DNA nějaké bakterie s genomem o velikosti asi 3-4 Mb. V takovém případě je potřeba dodat vzorek tak, že smícháte tento templát v množství asi 3 μg s primerem (25 pmol) v celkovém objemu 10 μl. Takto připravený vzorek sekvenujeme pomocí speciálního protokolu odladěného pro sekvenaci velkých templátů. Je-li chromozomální DNA čistá a vše se zdaří jak má, je výsledek k nerozeznání od sekvenace nějakého pcr produktu.

 

Příklad přímé sekvenace chromozomální DNA - dole hrubá data, nahoře elektroferogram perfektně čtený až do 1000 bp:

 

 

Pro cosmidy a BAC vektory platí obdobná pravidla. V souhrnu lze říci, že sekvenovat velký templát znamená na Vaší straně dodat ho hodně a na naší straně použít alternativní protokol. Kvalitu výsledku má primárně v rukou ovšem ten, kdo připravuje templát. Rovněž je potřeba mít na paměti, že riziko misprimingu je zde velké a dobře designovaný primer je samozřejmě rovněž klíčový předpoklad úspěchu.

Pozn.: Tuto službu nelze objednat on-line, v případě zájmu nás kontaktujte.

  

Richard Nádvorník, richard.nadvornik@seqme.eu

© SEQme s.r.o., 2012 - 2019. Všechna práva vyhrazena. Právní upozornění.
webdesign Beneš & Michl