Sangerovo sekvenovaní

Magazín

Znečišťování DNA na čistících kolonkách

Při přečišťování templátů pro DNA sekvenování (plazmidů nebo PCR produktů) se často využívají centrifugační kolonky v nichž je DNA navázána na silica matrici. Bohužel některé kolonky (i renomovaných výrobců!) mají takový tvar, že spíše než k přečištění dojde k znečištění templátu.

Předposledním krokem přečištění je stáčení prázdných kolonek jednu až dvě minuty s cílem je vysušit. Poté se přidává eluční pufr a po další krátké centrifugaci se získaný templát odesílá na sekvenování. Naneštěstí v templátu se mohou vyskytovat zbytky etanolu nebo solí z pufrů použitých během přečišťování. Ty měly být samozřejmě odstraněny právě v tom předposledním kroku, ale doby stáčení, doporučované výrobci souprav, jsou většinou příliš krátké a zejména díky tvaru kolonek a jejich sklonu v úhlovém rotoru může dojít k tomu, že tekutiny nejsou dokonale odstraněny při sušení kolonky a kontaminují produkt při eluci. Výsledkem je kontaminovaný vzorek.

Můžete si to poměrně snadno ověřit. Postupujte podle příslušného protokolu, ale těsně před elucí přeneste vnitřní zkumavku do čisté ependorfky a centrifugujte naprázdno 5 min při doporučené rychlosti. Ve většině případů uvidíte na dně ependorfky malý objem tekutiny, zřejmě etanolu (do cca 10 µl). Tento etanol inhibuje sekvenační reakci.

Co s tím? Nejjednodušší je centrifugovat naprázdno takových 3–5 min. Nicméně u některých zkumavek ani to nestačí, protože díky náklonu v úhlovém rotoru v nich zůstává malý „mrtvý“ objem. Doporučujeme proto centrifugovat naprázdno 2 min a poté, aniž zkumavky z rotoru vyjmete, otočit vnitřní zkumavku o 180º a centrifugovat další 2 min. Zachycené tekutiny byste měli tímto způsobem odstranit. Dokonale vysušenou vnitřní zkumavku pak přenesete do čisté jímací zkumavky a pokračujete v eluci podle doporučení výrobce.

 

Richard Nádvorník, richard.nadvornik@seqme.eu

© SEQme s.r.o., 2012 - 2019. Všechna práva vyhrazena. Právní upozornění.
webdesign Beneš & Michl