Sangerovo sekvenovaní

Magazín

Nízká koncentrace templátu pro sekvenování a co s ní lze dělat?

Správná (a dostatečná) koncentrace templátu je pro úspěch sekvenačních analýz naprosto zásadním parametrem. Pokud nemáte požadované množství templátu k dispozici, můžete snížit celkový objem zasílaných vzorků při dodržení koncentrace templátu i primeru. Navýšení objemu vzorku při zachování nízké koncentrace není řešením.

V této souvislosti je nutné také zmínit, že pro přesné stanovení koncentrace není vhodným nástrojem spektrofotometr (Nanodrop), kde výsledné koncentrace (zejména nižších hodnot) mohou být velmi zavádějící. Primery, proteiny i RNA absorbují při 260 nm a mohou tedy způsobit nadhodnocení koncentrace měřené DNA. Pro spolehlivou kvantifikaci DNA tedy doporučujeme agarózové gely či Qubit.

V prvé řadě je pro získání optimálního množství templátu pro sekvenační reakci důležité zvolit vhodnou izolační/purifikační metodu, event. optimalizovat PCR protokoly, kterými je DNA získávána. Pakliže je však vzorek již připraven a jeho koncentrace je nedostatečná, nabízí se v principu několik možností, jak se pokusit jeho koncentraci navýšit.

 

  • SpeedVac - Nejjednodušší řešení, pokud tímto přístrojem disponujete. Výhodou ve srovnání s jinými metodami je také to, že nehrozí možné ztráty DNA. Nutno však podotknout, že pokud byla DNA eluována do pufru, nikoliv do vody, bude odparem vody navýšena i koncentrace solí ve vzorku (event. jiných přítomných agens), které mohou mít v následujících analýzách negativní vliv.
  • Odpaření vzorků v termobloku - Možnou obdobnou variantou může být inkubace vzorku v termobloku/cykleru, vedoucí ke snížení objemu (s otevřeným víčkem zkumavky, např. při 58°C). Dobu inkubace je zde potřeba odhadnout dle počátečního objemu a rovněž zde platí, že dochází k navýšení koncentrace všech (i nežádoucích) složek vzorku.
  • Separace s pomocí paramagnetických částic (např. Agencourt AMPure XP) - S touto metodou máme velmi dobré zkušenosti, její výtěžnost je velmi vysoká a konečný objem lze snížit až několikrát (např. 10x). Výhodou také je, že nedochází k navyšování nežádoucích složek roztoku a lze tedy tento postup zvolit i v případě, že víme, že inhibitory jsou ve vzorku přítomny a chceme je odstranit. Zde je vhodné upozornit na opatrnost při závěrečném odstranění ethanolu, neboť po nadměrném přesušení kuliček může docházet k větším ztrátám DNA (zejména delších fragmentů).
  • Precipitace vzorku DNA - DNA je nejčastěji srážena ledovým ethanolem, případně isopropanolem, pokud je žádoucí udržet nižší celkový objem roztoku (isopropanol je však méně těkavý než ethanol a jeho eventuální zbytková přítomnost ve vzorku pak může inhibovat sekvenační analýzy). Za účelem navýšení koncentrace je pak následně DNA resuspendována v menším objemovém množství, než z jakého se vychází, nicméně je při této metodě nutné počítat s jistými (nezanedbatelnými) ztrátami. Při nízkých koncentracích DNA je doporučováno prodloužit dobu srážení a také stáčení v centrifuze.
  • Separace na kolonkách - Navýšení koncentrace DNA lze dosáhnout použitím sníženého objemu elučního pufru. Protokoly této metody lze navíc modifikovat takto: zahřát eluční pufr až na 70°C a po přídavku elučního pufru na membránu kolonku krátce stočit na velmi nízké otáčky (např. 50 g) pro zajištění, že se pufr dostane do celého prostoru membrány. Před finálním stočením vzorku lze prodloužit inkubační dobu, přibližně na 5-10 min. Při této metodě je však potřeba si uvědomit, že použití nízkého objemu elučního objemu sníží celkový výtěžek templátu a zároveň zvýší koncentraci všech kontaminantů, které vystupují z kolonky, stejně jako DNA.

 

V souhrnu je třeba konstatovat, že uvedené metody jsou spíš určeny pro jednorázové řešení problémů s koncentrací cenných vzorků než pro rutinní použití.

 

Martina Kujanová, info@seqme.eu

© SEQme s.r.o., 2012 - 2019. Všechna práva vyhrazena. Právní upozornění.
webdesign Beneš & Michl