Paralelní sekvenování amplikonů

Paralelní sekvenování amplikonů

Aneb jak sekvenovat stovky nebo tisíce amplikonů vašeho zájmu najednou (Tailed-amplicon library)

 

Pokud hledáte opravdu levnou možnost jak sekvenovat stovky nebo dokonce tisíce fragmentů DNA najednou, je sekvenování strategií Tailed Amplicon tou pravou volbou.

Ačkoli název zmiňuje amplikony, je tato strategie obecně vhodná pro libovolné fragmenty dsDNA nesoucí specifické přesahy na obou koncích (5´ a 3´), které nemusí být získány výhradně pomocí PCR. Ve skutečnosti je kompatibilní s fragmenty DNA generovanými štěpením tagmentázou (Illumina Tagment DNA TDE1 Enzyme) nebo fragmenty DNA, kterým jsou specifické přesahy ligovány. Dodané fragmenty DNA musí v každém případě nést specifické přesahy, jak je uvedeno níže!

Proč? Protože v naší sekvenční laboratoři jsou tyto specifické přesahy využívány k přidání další sady přesahů (adaptérů) potřebných pro sekvenování, včetně potřebných sekvenačních indexů. To umožňuje vysokou úroveň multiplexování. Tento přístup ponechává počáteční přípravu vzorku pod vaší plnou kontrolou, což vám umožní cílit na oblasti vašeho zájmu a současně pracovat s reagenciem dle vašeho výběru, ale bez nutnosti nákupu velkého počtu indexovaných adaptérů. Místo vás je dodáváme my a připravujeme sekvenační knihovnu pro následné sekvenování pomocí jakékoli platformy Illumina v naší nabídce.


Přehled

Krok 1 ve VAŠÍ laboratoři - Provedete PCR amplifikaci cílových oblastí a smíchání všech amplikonů ze stejného vzorku do jednoho poolu. Například, pokud máte 96 vzorků a 5 různých amplikonů na vzorek, provedete 5 x 96 PCR reakcí a smícháte amplikony pro každý vzorek dohromady. Výsledkem tedy bude jedna 96-jamková destička, 5 amplikonů v každé jamce.

Krok 2 v SEQme NGS laboratoři - Provedeme druhý krok PCR, v němž k vašim amplikonům přidáme indexy a sekvenační adaptéry, provedeme kontrolu kvality takto zpracovaných vzorků a spojíme všech 96 vzorků do jediné knihovny pro vlastní sekvenování.


Jak navrhnout primery

Připojte na 5’ konce vašich primerů: 

  • Forward: 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[specifická sekvence]
  • Reverse: 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[specifická sekvence]

Upozornění! - Pokud očekáváte amplikony s velmi nízkou komplexitou, zvažte použití primerů s tzv. spacery heterogenity (N, NN, NNN). N, NN a NNN jsou různé báze přidané za účelem zvýšení komplexnosti sekvence. Amplikony budou mít proměnnou délku (+0-3 bp), což povede k rovnoměrnému rozdělení všech čtyř bází pro každý sekvenční cyklus. Připojte k 5 'konci vašich primerů:

Forward:

  • 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[specifická sekvence]
  • 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGN-[specifická sekvence]
  • 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNN-[specifická sekvence]
  • 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNN-[specifická sekvence]

Reverse:

  • 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[specifická sekvence]
  • 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGN-[specifická sekvence]
  • 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNN-[specifická sekvence]
  • 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNN-[specifická sekvence]

 

Laboratorní zpracování

První krok PCR provedete pomocí primerů výše. V naší laboratoři pak budou vaše vzorky zpracovány následovně:

  • Amplifikace dodaných fragmentů DNA pomocí další sady primerů s přesahy (2. krok PCR)
  • Kvantifikace a pooling produktů PCR k dosažení optimálního vyváženého výtěžku sekvenování
  • Kvantifikace knihoven pomocí qPCR
  • Sekvenování na systémech Illumina

Výsledky

Získané sekvence budou roztříděny dle kombinace indexů do souborů reprezentujících jednotlivé vzorky a bude provedena analýza ukazatelů kvality sekvenace, jako je počet a délka sekvencí, phred score, %GC, úroveň duplikace atp.

Jako výstup obdržíte data ve formátu FASTQ rozdělená do souborů dle jednotlivých vzorků. Na přání lze výstupy zpracovat i v jiné formě. Tento požadavek prosím uveďte při objednání.


Doba zpracování

Méně než 4 týdny (nezahrnuje analýzu dat)


Požadavky na vzorky

Dodržujte naše Pokyny pro přípravu vzorků.

Vzorky musí být dodány přesně v koncentraci dle návodu! Příliš nízká koncentrace by mohla vést k nízkému výtěžku PCR, vysoká koncentrace k rozdílným výtěžkům nebo i inhibici reakce (vysoká koncentrace DNA může být spojena s vysokou koncentrací inhibitorů). Vzorky prosím dodávejte ve stripech nebo 96-jamkových destičkách.

Je nezbytně nutné, aby vzorky byly opatřeny přesahy, jak popsáno výše, rovněž musí být odstraněny přebytečné primery nebo adaptéry, zbytky enzymů atd. zašlete i obrázek agarózového gelu ukazující (reprezentativní) fragmenty DNA.

Celková délka fragmentů DNA musí být mezi 200 a 900 bp!


Jak službu objednat

Analýzu lze objednat jako balíček pro 24, 48, 94 nebo 190 vzorků.

 

 OBJEDNAT 

 

© SEQme s.r.o., 2012 - 2020. Všechna práva vyhrazena. Právní upozornění.
webdesign Beneš & Michl