Sekvenátory v naší flotile

Nabízíme Next-Generation sekvenování na těchto sekvenátorech

V případě specifických požadavků jsme schopni zajistit sekvenování i na dalších platformách

Poslední aktualizace: 21. února 2020. Zájemcům o NGS technologie doporučujeme náš pravidelný dvoudenní kurz! Více informací zde.

Aktuálně nabízíme zpracování vašich vzorků pomocí následujících technologií a přístrojů. S ohledem na rychlý technologický vývoj je možné, že přes veškerou snahu nejsou níže poskytnuté informace stoprocentně aktuální. 

 

 

NovaSeq6000, MiSeq (Illumina)

Sekvenátory Illumina disponují aktuálně nejvyšší možnou přesností čtení, chybují s frekvencí menší než jedna tisícina. K dispozici máme přístroje a čipy poskytující různý výstup sekvenačních dat jak do množství, tak do délky. Vhodným výběrem nastavení lze zajistit ekonomické využití přístroje. S jedním typem technologie lze tak realizovat experimenty s různými nároky na sekvenační kapacitu. Od sekvenace malých genomů, či amplikonů na systému MiSeq po analýzu velkých genomů či RNA na přístroji NovaSeq. Je možné provést pilotní experiment s nižší kapacitou a následně dle výsledků designovat experiment většího rozsahu apod.

Aktuálně jsme se rozhodli všechny high-throughput sekvenace převést na NovaSeq (vyšší kapacita, nižší cena, vyšší kvalita dat), takže přístroj HiSeq již nemáme v nabídce.

Všechny přístroje Illumina pracují s čipem zvaným flow-cell, který je u vyšších modelů rozdělen do několika drah.

NovaSeq6000 flowcell S4 (celková kapacita 3 Tb)

Tyto dráhy lze z hlediska sekvenování považovat za oddělené jednotky. V jednom sekvenačním běhu lze tedy sekvenovat více vzorků bez nutnosti indexování. S využitím indexování lze pak analyzovat i větší množství vzorků v jedné dráze. Nejvíce pokročilou metodou v tomto ohledu je použití unikátního duálního indexování.

 

 

PacBio Sequel a Sequel II (Pacific Biosciences)

Pro některé aplikace (např. skládání genomů nebo čtení delších amplikonů a repetitivních sekvencí) je potřeba získat delší sekvence. Toto je schopna poskytnout technologie SMRT využívaná v přístrojích společnosti PacificBiosciences. Délka přečtených fragmentů může být v průměru až 30 kb (Sequel I) nebo 50 kb (Sequel II) při vysoké kvalitě čtení, získat lze až asi 50 Gb (Sequel I) nebo 160 Gb (Sequel II) dat. Při přípravě vzorku pro sekvenaci nedochází oproti jiným technologií k amplifikaci templátu a je tedy možné zaznamenat přímo i některé epigenetické modifikace.

Detailní přehled aplikací

Templátem pro sekvenaci je cirkularizovaná molekula. Na tuto molekulu nasedá polymeráza a čte ji tak dlouho, dokud opět neodpadne či neskončí sekvenační běh. Fragmenty dlouhé řádově několik desítek kb  jsou takto opakovaně přečteny a porovnáním jednotlivých čtení, které provádí přístroj automaticky, je dosaženo zpřesnění správné identifikace báze. Tato strategie se nazývá „circular consensus sequencing“. Už při pročtení řádově 8-10x je přesnost čtení vylepšena na více než 99,99%, což je srovnatelné s přesností technologie Illumina. Zvolit si lze dle záměru experimentu cenově velice odlišné varianty. 10-hodinový běh na Sequel I pro menší genomy, amplikony nebo cDNA, až po 30-hodinový běh na Sequel II poskytující dostatek kvalitních dat (coverage ~30X) pro assembly až 3 Gb genomů.

(obr. upraven podle dokumentace PacificBiosciences)

 

 

GridION (OxfordNanopore)

Další technologií, která se zaměřuje na produkování dlouhých sekvencí, je technologie společnosti OxfordNanopore. V literatuře jsou již nyní popsány experimenty, kdy byly získány sekvence čítající až 2 Mb a délka čtení je v zásadě omezena pouze integritou nukleové kyseliny. Tato technologie zároveň pracuje s přímou detekcí bází, bez nutnosti amplifikace templátu, tudíž má potenciál i pro přímou detekci epigenetických modifikací.

Technologie OxfordNanopore se stále potýká s pověstí horší kvality sekvenování. Pravdou je, že překlad signálu na báze byl a stále je bolavým místem této technologie, neboť i přes neustálý a rychlý pokrok v této oblasti dosahuje přesnost čtení maximálně zhruba 95%. Stále je však možnost kombinovat dlouhé nepřesné sekvence s krátkými přesnými a získat tak daleko lepší de-novo assembly než by poskytly samotné krátké ready získané technologií Illumina. Navíc pokrok v dekódování signálu je velmi rychlý a i "stará" data lze přeanalyzovat s novými algoritmy.

 

 

Chromium Controller (10xGenomics)

Přístroj Chromium Controller do této sekce de-facto nepatří, jelikož to není sekvenátor, ale systém pro přípravu sekvenačních knihoven, má však určité zajímavé technologické možnosti. V sekvenační knihovně vytvořené tímto přístrojem jsou všechny fragmenty pocházející z jedné konkrétní molekuly (>50 kb dlouhé) opatřeny totožnou identifikační sekvencí (barkódem), což umožňuje získané krátké sekvence seskupit dle jejich příslušnosti k mateřské molekule a získat tak unikátní přidanou informaci, která v konečném důsledku umožňuje daleko přesnější zpracování dat. Přístroj je takto schopen využít až 750.000 různých barkódů.

Druhou atraktivní možností tohoto přístroje je označit unikátním identifikátorem všechny polyA RNA pocházející z jedné buňky. Tím se otevírají netušené možnosti studia exprese individuálních buněk.

 


 

Orientační srovnání sekvenátorů

 

Sekvenační systém Čip/Sekvenační chemie Možné varianty sekvenování Max. délka čtení Maximální počet sekvencí na čip/dráhu v jednom běhu (v miliónech) Maximální počet přečtených bazí na jeden čip/dráhu (v Gb)
MiSeq (Illumina)1 MiSeq Reagent Kit v2 SE/PE 2x250 b 30 7,5
MiSeq Reagent Kit v3 2x300 b 50 15
NovaSeq6000 (Illumina) SP FlowCell SE/PE 2x250 b 800 600
S1 FlowCell 2x150 b 1600 750
S2 FlowCell 2x150 b 4100 600
S4 FlowCell 2x150 b 5000 750
SEQUEL (Pacific Biosciences)2 SMRT Cell 1M HiFi Reads Q2+ <20 kb 0,5 20
Long Reads Q2+ >150 kb 0,5 50
SEQUEL II (Pacific Biosciences)2 SMRT Cell 8M HiFi Reads Q2+ <20 kb 4 60
Long Reads Q2+ >150 kb 4 160
GridION X5 (Oxford Nanopore Technologies)3 RevD FlowCell Native DNA/RNA ~2 Mb 3 30
PCR processed DNA/RNA ~2 Mb 3 10

 

1 - U sekvenačních knihoven s nízkou sekvenční diverzitou (amplikony, mRNA, miRNA apod.) existuje řada technologických omezení, kvůli kterým nelze dosáhnout uvedených maximálních výstupů, více info zde
2 - Množství sekvenačních dat a jejich kvalita velice úzce souvisí s délkou fragmentů, které jsou použity pro tvorbu sekvenační knihovny, více info zde.
3 - Sekvenační výstup výrazně závisí na charakteru vzorku a nastavení sekvenace, více info zde.

 

© SEQme s.r.o., 2012 - 2020. Všechna práva vyhrazena. Právní upozornění.
webdesign Beneš & Michl